Z3 - Proteomik und Lipodomik-Analytik mittels Massenspektrometrie und NMR

Die Funktionalität des Fettgewebes wird durch verschiedene molekulare Prozesse charakterisiert. Dazu gehören (1) die eigenen Stoffwechselleistungen, (2) die Interaktionen mit dem systemischen Stoffwechsels mittels Metaboliten und Adipokinen und (3) die Wechselwirkungen mit Immunzellen wie Makrophagen. Für die Analyse dieser Prozesse bedarf es einer breit aufgestellten bioanalytischen Kompetenz. Im Einzelnen werden für die gerichtete Quantifizierung von Proteinen aus Serum und Gewebe Assays für die verschiedenen Adipokine wie Chemerin und Leptin entwickelt. Deren Anwendung in der Hochdurchsatzanalytik wird die Korrelation zwischen Genvariationen, Phänotyp und Adipokinkonzentrationen ermöglichen. Mittels globaler Proteomics werden Veränderungen in der Differenzierung von Adipozyten und im Gewebe detektiert werden und durch Phosphoproteomik die daran beteiligten Signalwege identifiziert und quantifiziert. Die gerichtete Quantifizierung einer Adipositas-spezifischen Auswahl von Metaboliten im Serum und Gewebe wird zur Charakterisierung der Effekte von veränderten Fettgewebsfunktionen beitragen.

Neben der Proteinanalytik spielt im Projekt auch die Lipidanalytik eine tragende Rolle. Zusätzlich zur Untersuchung der Speicherfette (Triacylglycerole) in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Nahrung und bestimmter Stoffwechselstörungen, die durch "knockout" bestimmter Enzyme simuliert werden, ist auch die Analytik der Phospholipide von hoher Relevanz. Hier interessieren wir uns insbesondere für Phospholipide mit "messenger"-Funktion sowie für Lipidoxidationsprodukte, die unter entzündlichen Bedingungen durch reaktive Sauerstoffspezies gebildet werden. Neben massenspektrometrischen Verfahren (ESI und MALDI) sollen auch NMR-Verfahren Anwendung finden, da die NMR trotz ihrer geringen Empfindlichkeit eine Vielzahl von Vorteilen bietet: So ist es z.B. mittels hochauflösender 31P-NMR-Spektroskopie die Detektion und Quantifizierung sämtlicher Phospholipide auch in komplexen Gemischen möglich ohne dass eine Trennung notwendig ist. Die 13C-NMR wiederum ermöglicht die direkte Zuordnung der Fettsäurereste zu den einzelnen Positionen des entsprechenden Trilglycerols.

Abbildung 1: SRM-Methode zur gerichteten Quantifizierung von Adipozytokinen. (A) Die Methode beruht auf der Verwendung von zwei Massenfiltern und der Quantifizierung an Hand von Massenübergängen. (B) In Oberbach et al. (2015) wurde die Methode für die Quantifizierung von zunächst 4 Serumproteinen etabliert.

Abbildung 2: Einfluss der Diät auf die Fettsäurezusammensetzung in braunem Fettgewebe. (A) Das Fettsäureprofil im Futter und im Fettgewebe zeigt klare Unterschiede. (B) Mittels NMR können auch die Positionen der Veresterungen bestimmt werden. In (2A) ist der Einfluss unterschiedlicher Diäten auf die Fettsäurezusammensetzung von braunem Fettgewebe (Maus) dargestellt. In der verwendeten x:y Nomenklatur gibt "x" die Zahl der C-Atome in der Fettsäure an, während "y" der Anzahl der Doppelbindungen entspricht. Die Positionsbestimmung der einzelnen Fettsäurereste in den Triacylglycerolen ist mittels 13C-NMR-Sektroskopie möglich (2B). In vielen Fällen kann hier zwischen sn-1,3- und sn-2-Position differenziert werden.

 

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PROJEKT TEAM

Yulia Popkova, Postdoc

Alexandra Schaffert, Doktorandin

Laura Krieg, Doktorandin